正向连接：

即目的基因顺时针地按其上游到下游的方向与载体相连(与启动子的顺时针方向一致),这样,目的基因就能从上游到下游正常转录,表达产生所需的蛋白质,产生预期的性状。

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目的基因也可以与质粒反向连接(反向连接)，即目的基因的上下游方向颠倒地与载体相连，结果目的基因的转录从下游到上游，导致密码子全部改变，目的基因不能正常表达。为了防止出现反连现象，实验中常用双酶切的方法。

如果目的基因连接反了，就不能表达了，原因是基因表达载体上面有基因表达需要的部件，例如启动子等，即有方向性。假如是一种限制性核酸内切酶来切割重组的基因表达载体，就需要用一定的方法进行筛选。